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十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種常用的蛋白電泳。經(jīng)典SDS-PAGE蛋白電泳凝膠，由兩種不同濃度的丙烯酰胺溶液形成的不連續(xù)凝膠（濃縮膠和分離膠）。

1、凝膠材質(zhì)

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結(jié)合使用。 交聯(lián)劑雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反應(yīng)-通常由過硫酸銨(APS)引發(fā)。在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。
蛋白電泳，通常采用30%或30%+(%T)的聚丙烯酰胺凝膠。通過改變基質(zhì)的百分比來調(diào)整孔徑大小，從而有效分離不同大小的蛋白。聚丙烯酰胺凝膠的含量與蛋白大小成反比。

分離膠中丙烯酰胺比例和分離蛋白大小的關(guān)系

2、變性劑

SDS是一種陰離子去污劑。SDS-PAGE蛋白電泳中,SDS與蛋白質(zhì)緊密集合,將蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開,引起蛋白質(zhì)構(gòu)想的改變,其所帶的電荷與蛋白質(zhì)有大大的差異,因此消除或掩蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷。電泳時的蛋白的遷移率就不在受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響,而只與蛋白質(zhì)大小有關(guān)。

常用SDS-PAGE蛋白電泳分離膠和濃縮膠配置表

凝膠配置試劑

3、電泳緩沖液

經(jīng)典SDS-PAGE蛋白電泳緩沖體系（Tris Glycine）工作原理：

上層濃縮膠，由較低濃度丙烯酰胺溶液形成（一般丙烯酰胺濃度為4-6%）。濃縮膠體系中的氯離子（Cl-）作為先導(dǎo)離子，以較快的速度向正極遷移。在其后面形成一個電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，加快了蛋白質(zhì)和甘氨酸離子（Gly)的遷移。由于濃縮膠中的pH較低（一般pH=6.8），甘氨酸的負(fù)離子效應(yīng)不明顯，作為尾隨離子，遷移較慢。所以，進(jìn)入分離膠之前，蛋白堆積在氯離子、甘氨酸離子之間，有利于提高電泳的分辨率。

進(jìn)入下層分離膠后，pH升高(分離膠通常pH=8.8)，使甘氨酸解離成負(fù)離子效應(yīng)增加，使甘氨酸的遷移超過蛋白質(zhì)。另外，由于分離膠中的丙烯酰胺濃度明顯高于濃縮膠，一般丙烯酰胺濃度為8-15%。蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其性質(zhì)分離。在非變性蛋白凝膠電泳中，按荷質(zhì)比分離蛋白。在SDS-PAGE變性蛋白凝膠電泳，按相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)。

Tris Glycine緩沖體系電泳緩沖液組分

電泳緩沖液配置試劑

除了(Tris-甘氨酸)緩沖系統(tǒng)，聚丙烯凝膠蛋白電泳緩沖系統(tǒng)也衍生出了一系列進(jìn)化緩沖系統(tǒng)。Tricine緩沖系統(tǒng)中，用Tricine替代了傳統(tǒng)Tris-甘氨酸系統(tǒng)中的甘氨酸，使得低分子量蛋白（2-20 kDa）電泳具有更高的分辨率。Tris-醋酸鹽凝膠可以用于大分子量蛋白（＜500 kDa）的分離。

4、蛋白染料

考馬斯亮藍(lán)R250染料是SDS-PAGE中最常用的蛋白染色之一。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在549納米處有最大的吸收。每個正電荷氨基酸約1.5-3個考馬斯亮藍(lán)R250分子將被結(jié)合。靈敏度在200-400ng左右。而考馬斯亮藍(lán)G250主要應(yīng)用是Bradford法(測定蛋白質(zhì)濃度)，但也可以對聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。

蛋白染料

5、上樣緩沖液

上樣緩沖液通常包含密度成分、SDS、染料、緩沖體系。密度成分幫助樣品沉入凝膠孔中，SDS是一種陰離子去污劑，染料則用于指示電泳的進(jìn)展。對于還原蛋白電泳，還需在上樣緩沖液中加入還原劑，降低二硫鍵的生成。

上樣緩沖液組分